本文为系列文章《大分子生物分析概论》的第九篇，旨在根据已发表的文献资料，介绍大分子生物分析中对关键试剂的管理。

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1.导论

配体结合式测试方法（ligand binding assays, LBA）广泛地用于测定生物药在动物和人体体液中的浓度，从而评估其药代动力学、免疫原性以及与疾病相关的生物标志物。

是而这些测试方法的基础则是试剂，LBA方法的特异性、选择性和灵敏度都取决于这些试剂。

受药物的应用、开发阶段、业务和资源的影响和限制，LBA试剂的多样性及其应用，演进出多样化的管理方法。例如，非临床毒理学（TK）和临床药代动力学（clinical PK）的分析任务可能类似；但对用于临床检测方法，随着新药项目通过临床开发的不同阶段，需要对试剂的多个批次变化及其长期存储的稳定性进行管理。

虽然没有一个适合所有状况的应对方法，管理试剂生命周期的努力往往分为两类：（1）对大量使用的某一个批次的试剂，其存储稳定性和物流将是主要问题；（2）如果使用小批次，批次更改的管理将是主要问题。业内已然认识到，某些试剂至关重要，其变化会显著地改变或削弱使用它们的测试方法的性能。对关键试剂的控制是保证LBA测试方法的质量和效能长期一致的基础。

尽管目前的监管指南为PK和免疫原性测试方法的验证提供了非常具体的指导，但一般没有就关键试剂的生命周期的许多方面提供足够的指导，包括试剂的稳定性。美国FDA和欧洲药品管理局（EMA）发布的生物分析方法的指南只是提供了一些与关键试剂相关的关注点。在日本，关于LBA的指南草案现已公开审议。巴西、中国和印度则没有任何相关指南。已发布的指导文件和白皮书对关键试剂的管理大多只是泛泛而谈，在如何管理不断变化的关键试剂方面缺乏通用的实际操作指南：包括重要和次要批次更改、文档记录、测试试剂的稳定性及其性能标准和批次间的连续性。因此，整个行业需要一个统一的方法，以提高一致性，并基于健全的科学和监管原则作出相关决策。

经过研究有关LBA关键试剂的全球指南和文献，本文总结出如下共识和最佳做法供讨论和实施：根据经验和研究已发表的文献，试剂需要在测试方法的生命周期的背景下加以考虑和管理。特别是，对一个关键试剂的表征，对于最初选择该试剂和在该测试方法的整个生命周期内有效地供应这个关键试剂，非常重要。

以下主要关注四个方面：

• 关键试剂的记录文档

• 内部关键试剂与商用试剂的异同

• 关键试剂的更换

• 关键试剂的稳定性。

本文不打算考虑的议题包括参比试剂（reference standards）和内标（internal standards），基于细胞的PK测试方法和抗药物抗体（ADA）检测所需的样本基质以外的基质。

总体而言，对于关键试剂管理存在着多种做法的结论，在某些领域形成了高度共识。值得一提的是，相关调查结果表明，有关文档记录的监管指南有不一致之处，特别是对于批次变更，只有约 50% 的法规指南具有解决批次变更的程序。大多数被调查者表示拥有关键试剂的生产程序，但没有过期后有效期再延长的程序。

2.建议和最佳做法

关键试剂的定义

虽然在某些情况下，测试方法的任何组成成分对其性能都可能至关重要，但对任何特定测试方法的关键试剂都需要产生一个准确定义。难以生产、替换、获取或取代的试剂可被视为稀有关键试剂；相反，更通用的试剂，如抗轻链或重链抗体，在某些检测中也可能至关重要。免疫捕获与LC-MS结合的测试方法可能需要将捕获抗体视为关键试剂，即使是测试缓冲液或阻断试剂也可能对ADA检测的性能至关重要。如果需要将某个试剂定义为关键试剂，就需要主动地管理试剂的可及性和可重复性，应当通过制定书面的相关程序，用以定义某些试剂为关键试剂，并在整个测试方法的生命周期内管理这些试剂。

虽然大多数监管机构尚未定义关键试剂，但确实讨论了LBA相关试剂的关键性质。2001年发布的FDA《生物分析方法验证的行业指南》中将一些试剂定义为重要和关键（key and critical），并概述了在测试方法的整个生命周期中管理这些试剂的各个方面，包括交叉反应性（cross-reactivity）、储存条件的定义、稳定性评估以及当批次改变时，评估抗体和标记了的被分析物（示踪剂，tracer）的性能，都表明了这些试剂的关键性质和是需要评估的。

这些评估的需求可以很容易地扩展到其它的LBA试剂。2011年EMA生物分析方法验证指南支持并拓宽了2001年FDA指南中的关键/关键试剂的概念。这些指南认识到测试方法的特异性是由所使用的试剂决定的，对关键试剂的控制对于测试方法的质量和长期保持其效能是至关重要的，监管机构和一些文献都提出将某些试剂确定为关键试剂。

本文建议定义以下关键试剂：对待测物（analyte）特异性的LBA分析试剂通常被视为关键试剂（抗体，多肽，蛋白质，耦合物（标记），作为试剂的药物和ADA试剂（阳性和阴性对照品）。EMA指南将关键试剂定义为"...结合试剂（binding reagents），例如，结合蛋白、aptamer、抗体或耦合后的抗体）和那些含有酶活性域，对测定结果有直接影响的试剂......"。生物分析界同意并扩大这一定义，以包括多肽，如受体或配体及它们的片段。监管指南非常明确地说明了，对于PK标准品（PK reference standards），需要如何作为标准品进行控制和评估。然而，PK标准品也可以成为一个关键的试剂，无论是在免疫原性还是靶标生物标志物的检测中（通常是在耦合后）。

生物标志物的校准物（Biomarker calibrators）通常远不如药物标准品（drug reference standards）的表征充分。因此，批次变化更难于控制，而且往往得不到来自认可源头（例如，US Pharmacopeial Convention）的校准物。虽然生物标志物校准物不在本文讨论的范围内，但可以总结性地指出，关于生物标志物校准物的具体指南通常都缺乏，因而在预期做法与实际操作之间存在很大差距。

3.关键实际的表征（Characterization）和认证（Qualification）

关键试剂的质量是稳健地开发测试方法所必须的基本组成部分。测试试剂是根据它们对待测物（the analyte of interest）的特异性和样本基质以及其它试剂的交叉反应特性而开发和选择的。在方法开发之前和期间，可以通过多种方式测试这些试剂的特异性和交叉反应性。理解选择这些试剂的方式、原因以及性能，对于选择和认证新批次的试剂（如果需要的话）是非常重要的。

临床和实验室标准研究所的指南强调需要对试剂进行表征，并提供了关键特性的指导。一旦测试方法开发完成并确定了关键试剂，就可以定义重新供应（resupply）关键试剂的风险。例如考虑复杂的免疫策略。对于商业来源的试剂，稀缺性（rarity）是主要挑战（例如，单一供应商/供货商，细胞株的可及性）；对于内部试剂，纯化和耦联的复杂性或是挑战可能。监管指南指出，关键试剂的表征和认证应针对预设的用途，但是所需要的试剂表征的程度，对给定的测试方法而言，差别可能很大。

因此，本文不详描述试剂表征和初始认证的评估范围，而是仅仅建议：进行足够的表征，以便在生成新批次时，实现某种形式的一致性（consistency）和过程控制（process control），并且这种认证是有据可查的。试剂特征包括但不限于：身份(identity)、来源、纯度、浓度（或滴度）、结合亲和力（bindingaffinity）、等型（单克隆/多克隆抗体）、分子量、特异性（specificity）、成合比（incorporation ratio）和聚合程度(aggregation level)。若干文献详细讨论了关键的试剂表征和测试方法，药物开发的阶段也是投资试剂表征的程度和范围的考虑因素之一。

4.关键试剂的采购

考虑获得足够数量的关键试剂，无论是内部制备的，或是从商业来源采购的，最好是能够满足整个华体会电竞 的需要。试剂可以在内部生产，也可以作为定制生产或现成的试剂从商业来源获得。然而，选择关键试剂的可靠来源，这个看起来显然很简单的任务，却并非易事。这可能需要仔细规划、考虑利弊以及进行尽职调查。

内部生产试剂

可获得内部定制生产的试剂，以适应所设计的测试方法; 可以对其预设的用途，进行大范围表征，可以自定义分析证书（CofA），产生稳定性数据等。更重要的是，可以监测和控制批次间的变异性（特别是在标记蛋白质时）。此外，对内部生产的试剂的管控，可能允许更好地进行生命周期管理。然而，内部生产试剂需要熟练的人员以及大量的投资，以建立一个试剂生产的基础设施和预先规划的生产过程。

商业生产的试剂

商用试剂广泛地用于各种格式的LBA的开发。商业试剂的主要优势包括：可以从多个供应商处立即获得各种试剂，通常对预设用途做过表征并附带有某种 CofA。此外，可以从多个来源获得各种检测试剂（标记过的蛋白），并在其中找到，对某个特定测定方法而言，性能卓越的检测试剂。

除了现成的试剂外，许多供应商还提供定制生产和特定试剂的表征。这种方式的主要好处是：信誉良好的测试试剂的制造商通常拥有完善的生产设施，技术能力和知识储备，可以有效地支持试剂的生产和应用。此外，它们还可以为最终用户提供出色的支持，包括定制试剂的生成和耦合以及解决应用中出现的问题。

然而，使用商业试剂并非没有挑战。有几个与商业试剂有关的问题，可能需要仔细考虑。其中一些列在表1中，包括缺少试剂的稳定性数据、缺少可用的试剂规格/批次放行的验收标准（尽管某些供应商可能会应客户的要求提供该标准）以及缺乏相关试剂的其他基本信息。

最大的挑战是未标记和标记的试剂批次之间的变异性。在使用多个批次试剂的长期研究中，这可能会造成桥接数据的困难。生产商改变关键试剂的批次并不罕见，例如用于生产偶联体的多克隆抗体池，它们可能符合批次放行的规范，但可能对最终用户构成重大风险。此类变更很可能无法及时传达给最终用户。此外，特定试剂的生产可能会终止，并且不会提前通知客户。

关于关键试剂采购的建议

鉴于商业试剂来源于能力（雄厚的技术，支持性文件的实力，有提供多批次产品的能力）各不相同的多个供应商，谨慎的做法是进行尽职调查和可行性评估，以选择可靠的试剂和供应商。无论试剂是在内部生产还是从商业来源获取，了解试剂具体特征的需求都是一样的。与供应商建立密切关系是非常有益的，这有助于扩展技术支持的范围，以提高故障排除率，解决试剂相关问题，及时获取有关试剂批次变化的信息和确保特定批次的长期供应。此外，如果只有一家关键试剂的供应商，则建议考虑建立某种合同关系，这些合同关系可以给用户预警产品更改或生产停止。下面列出了值得考虑的若干的要点：

& 来自不同供应商的相同浓度单位的重组蛋白和多肽在一个测试系统中可能有不同的表现。因此，选择并保留足够数量的试剂以满足长期需要是有益的。在某些情况下，如果已在验证期间确定一个校正因子，或者已生成能支持该校正因子的实验数据，则可考虑使用校正系数来补偿内容和比例错误（content and proportional errors）。

& 供应商通常拥有质量控制/质量保证和批次放行的流程。尽管通常不能审核这些流程，但在某些情况下，可能有机会对供应商的设施进行QA审计。

& 通常可以通过提出特定请求可以获得通常不伴随着试剂提供的文件（例如，与试剂的表征，稳定性，批次放行规范，等，相关的文件）。

& 商业化生产的预涂层固相支持物件，如电化学发光和ELISA板材和珠子可能需要被视为关键试剂。应该建立和记录与这些关键试剂相关的内部流程，如批次验收测试，以确保板材的涂层均匀，尤其是在使用条带的情况下。对于使用商业试剂构建的内部生物标志物的检测方法，应使用含有内源性被分析物（endogenous analyte）的混合（pooled）生物基质（如血清/血浆）作为QCs，用来监测不同批次的商业试剂的性能。

& 解释生产商的失效期数据，作为该试剂的测试/再测试的依据，因为该试剂在超过"到期日期"后，可能仍适用于预期用途。请参阅“试剂稳定性”部分，以得到相关的详细指导。

表1.从内部和商业来源获得的试剂的有关注意事项

5.关键试剂的更换

用于配体结合测试方法的试剂通常由生物生产过程生产，而不是一个完全可控的合成过程。这将导致不同批次之间的可变性和异质性。蛋白生产出来之后，通常有纯化和标记步骤，这更增加了产品的复杂性。此外，通常需要在很长的一段时间里，使用这些测试方法，以支持一个药物的整个生命周期，这意味着可能需要多个批次的试剂来支持长期的测试。

为了尽量减少批次之间的可变性，必须拥有规范良好，并且前后一致的试剂生产流程；也必须按照相关的生产方案和标记程序(labeling procedures)生产，并且完整地记录整个流程。

但是，方案（protocols）和程序（procedures）的详细程度往往不合适（见最近的例子见15）。所以必须认识到：对生产程序的描述越详细，试剂生产的可重复性就越大，更换关键试剂可能是面临的最重大的挑战之一。在2001年生物分析方法验证指南中，FDA指出“...如果更改关键试剂，则可能需要重新优化或验证该测试方法”。此外，EMA指南规定，当试剂批次更改时，必须确认测试方法的分析效能，“以确保与原始批次或上一批次的试剂相比，该方法的效能不会改变”。

对试剂的任何操作都代表该试剂成为一个新的批次（包括稀释）。O'Hara等人将试剂或某个批次试剂的更改归类为需要不同评估的级别：即主要和次要的更改。这样的评估是由科学驱动。建议事先确定一套明确的绩效评估方法和验收标准，并详细记录验收标准和相关实验。相关文件可以是指导试剂更改的标准操作程序（SOP），也可以作为最终方法报告的一部分。

事实上，并非所有生物分析实验室都有相应的程序或者正式的SOP，用以管理试剂批次的变更。在某些情况下，认证可能只是使用新试剂批次的单个测试运行，或者在同一运行中使用新和旧试剂的单个测试运行。与旧批次比较是有用的，但不是绝对需要的，因为在许多情况下，旧（或原始）批次可能已经用完。某些实验室拥有定义更明确的、用于批次变更的测试方法验证程序。在某些情况下，对新试剂的定义也可能存在一些差异，例如从同一原始材料生产出来的新批次。

业界最初认为，新批次试剂的认证和稳定性测试的接受标准应包括最大的仪器响应。然而，对基于仪器响应的信号控制图（signal control charts）的效用有不同意见。因此，需要关注下列事项：用于生成检测信号的分析平台；比较同一仪器随时间而获取的信号的能力；比较不同仪器的所产生的信号的能力以及环境温度等变量的影响。

关于更换关键试剂的建议

本文建议在一个功能性测试中测试新试剂，并采用预先验设立的检测验收标准。下面提出了认证这些关键试剂的两级式方法，测试的范围是由该试剂的变化程度，或者这些变化可能产生的影响程度所驱动的。在测试中，通常使用外加待测物的QCs来定义该方法的效能，但对于生物标志物的测定，可能需要包括含有内源性待测物（endogenousanalyte）的，基于真实样本的QCs，以确保commutability（可变性）。

细微变化

试剂的细微变化被定义为预期对测试性能影响极小的试剂改变；因此可以实施相关改变，而不会对数据生成产生任何有害影响。这种细微变化的例子是一个从以前认证过的原液发展而来新的试剂批次，如：从相同动物的多克隆血清做的新一次亲和纯化的产品；或使用相同批次的蛋白质做的新一次耦合反应，而该耦合过程已经被证明是受控良好的。用于制备新一个试剂批次的过程应与用于生成原始批次的过程相同。第一个测试级别包含所有试剂的资格认证计划中所共有的测试（图1）。

& 推荐测试运行一次，包括3个级别的QC样品，但更理想的是包括定量下限和上限在内的，总共5个QC，因为定量范围的两个极端是PK和生物标志物测试方法最脆弱的地方。对于免疫原性测试，应包括3个级别的QC样品，包括接近切点的阴性和低阳性对照样品。

& 如果同时更换多个试剂，则可以使用同一检测方法一起测试并认证这些试剂。建议执行多个测试运行，以提高对结果的信心，并且最大程度地降低接受假阳/阴性结果而导致的风险。但是，如果一次只更换一个试剂，则一次运行可能就足够了。

& 建议在可能的情况下，并行地测试当前试剂与原始试剂。与原始批次的比较在监视或控制测定方法性能的漂移方面非常有用。但是，在没有可比较批次的情况下，对最大信号和/或 QC信号的监控就变得更加重要了。

& 一旦从适当的认证测试生成了可接受的数据，其结果应作为能够接受试剂更换的记录，无需再做进一步认证。

& 在结果不符合接受标准的情况下，可能需要进一步单独测试以确定失败的原因。单次失败可以通过重新制备一次标准样品和QCs，并重新测试来补救。然而，反复的失败至少会表明需要制备一个新试剂批次，并可能重新优化该测试方法。反复的失败也可能表明需要生产一批新的原始试剂；但这将被视为一个重大变更。

& 建议监控QC样品的最大仪器响应，但仅仅作为判断测试方法性能的一个工具，而不是作为接受标准。随着在较长持续时间内或较大研究中收集，整理更多的数据，跟踪QC最大仪器响应趋势的价值会随之增加。

重大变更

这是最高的试剂认证级别，主要适用于在一个试剂的原始来源枯绝，需要更换关键试剂的情况。此时，将确定新的供应商，表征新的试剂，并证明新试剂的测试性能。

重大变化的例子包括从新动物获得的抗体批次、用于单克隆抗体生产的新克隆，或用于生产重组物料的新细胞系。其中每个变更都预期需要广泛的重新认证。为了维持测试方法的性能，一个不太明显，但有时是必不可少的任务，可能是采用一个新批次的阴性对照品，这对于免疫原性测试的关系特别重大。除采纳对试剂细微变更时的认证建议外，对测试试剂的重大变更也应考虑采取以下行动（图1）：

& 应至少执行三次测试运行，以表征新试剂的测试性能。

& 在多次运行中，并行测试新试剂和原始试剂。如果新试剂不符合测试接受标准和/或其测试性能发生变化，但试剂仍然适合用于测试目的，则新试剂可能是可以接受的，但需要更广泛的认证，如部分方法验证。

& 还需要其他数据来描述和正确记录新试剂对测试方法参数的全面影响。

图1.关键试剂管理流程的总结

10.特别声明

本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊, 官方网络报道, 等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。

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